کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک تکنیک جداسازی است که از فاز متحرک مایع برای جداسازی اجزای یک مخلوط استفاده می کند. نمونه ابتدا در یک حلال حل می شود، سپس تحت فشار بالا مجبور به جریان در ستون کروماتوگرافی می شود. در داخل ستون، مخلوط به اجزای تشکیل دهنده آن تجزیه می شود. ستون‌های HPLC منفرد ممکن است از هر یک از چندین فاز یا فرآیندهای مختلف برای القای این تفکیک استفاده کنند، از جمله فاز باند معمولی، فاز معکوس، حذف اندازه، حذف یون و تبادل یون.

آناتومی و موارد استفاده

ستون‌های HPLC فاز با پیوند معمولی از یک بستر ثابت که ماهیت قوی قطبی دارد و یک فاز متحرک که غیرقطبی است تشکیل شده‌اند. بنابراین، نمونه‌های قطبی در سطح قطبی ستون به مدت طولانی‌تر از مواد قطبی کمتر باقی می‌مانند. این تکنیک با نمونه‌های حساس به آب، آنالیت‌هایی که در آب نامحلول هستند، ایزومرهای هندسی خاصی که جداسازی آنها با فاز معکوس دشوار است و جداسازی طبقاتی به خوبی کار می‌کند. حلال‌های آلی مورد استفاده در جداسازی‌های فاز معمولی نسبت به برخی از بافرهای معمولی که در HPLC استفاده می‌شوند، سازگاری بیشتری با طیف‌سنجی جرمی (MS) دارند. در HPLC فاز معکوس، شرایط عملیاتی گاهی اوقات باید به طور چشمگیری اصلاح شود تا امکان سازگاری با تشخیص MS فراهم شود.

فاز معکوس

ستون های HPLC فاز معکوس برعکس کروماتوگرافی فاز معمولی هستند. بستر ثابت در طبیعت غیر قطبی (آب گریز) است، در حالی که فاز متحرک یک مایع قطبی است، مانند مخلوطی از آب و متانول یا استونیتریل. هرچه دیفرانسیل قطبی کمتر باشد، ماده طولانی تری حفظ می شود.

حذف اندازه

در کنار گذاشتن اندازه، ستون HPLC با موادی پر می‌شود که اندازه‌های منافذ دقیقاً کنترل شده دارند، و نمونه با توجه به اندازه مولکولی حل‌شده‌اش توسط فاز ثابت غربال یا فیلتر می‌شود. مولکول های بزرگتر به سرعت از طریق ستون شسته می شوند و مولکول های کوچکتر به منافذ ذرات بسته بندی نفوذ کرده و بعداً شسته می شوند.

حذف یون

در طرد یونی، آنیون‌ها در فاز ثابت بیشتر از ستون‌های تبادل آنیون باقی می‌مانند. بنابراین در صورتی که مقادیر زیادی آلاینده کاتیونی در نمونه وجود داشته باشد، کمی سازی ساده می شود.

تبادل یون

در تبادل یونی، بستر ثابت با ستون HPLC دارای یک سطح باردار یونی با بار مخالف با یون های نمونه است. این تکنیک تقریباً به طور انحصاری با نمونه های یونی یا قابل یونیزاسیون استفاده می شود. هرچه بار روی نمونه قوی‌تر باشد، قوی‌تر به سطح یونی جذب می‌شود و بنابراین زمان بیشتری برای شستشو خواهد داشت. فاز متحرک یک بافر آبی است که در آن از هر دو pH و قدرت یونی برای کنترل زمان شستشو استفاده می شود.

استانداردها

اینها استانداردهایی هستند که به طراحی و استفاده از ستون‌های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مربوط می‌شوند.

ASTM D5315 - روش تست استاندارد برای تعیین N-متیل-کاربامویلوکسیم ها و N-متیل کاربامات ها در آب با تزریق مستقیم آبی HPLC با مشتق گیری پس از ستون
BS EN 16187 - مواد غذایی - تعیین فومونیزین B1 و فومونیزین B2 در غذاهای فرآوری شده حاوی ذرت برای نوزادان و کودکان - روش HPLC با پاکسازی ستون ایمونوافینیتی و تشخیص فلورسانس پس از مشتق سازی قبل از ستون
DIN EN 14132 - مواد غذایی - تعیین اکراتوکسین A در جو و قهوه بوداده - روش HPLC با پاکسازی ستون ایمونوافینیتی

منبع

globalspec