تجهیزات الکتروفورز ژل
به روز رسانی شده در ۱۴۰۳/۷/۲۲ زمان مطالعه 10 دقیقهتجهیزات، ابزارها و منابع الکتروفورز ژل، اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین ها را بر اساس اندازه، بار الکتریکی و سایر خواص فیزیکی جدا می کنند. الکتروفورز ژل در پزشکی قانونی، بیوشیمی، ژنتیک، میکروبیولوژی و سایر کاربردهایی که نیاز به تجزیه و تحلیل اندازه و خصوصیات مولکول اسید نوکلئیک و پروتئین دارند، مفید است. الکتروفورز پروتئین نیز یک روش رایج برای آنالیز پلاسمای خون در کاربردهای پزشکی است. الکتروفورز اغلب به عنوان یک تکنیک آماده سازی قبل از شبیه سازی، تعیین توالی DNA، ساترن بلات، پلی مورفیسم طول قطعه محدود (RFLP) و تجزیه و تحلیل از طریق طیف سنجی جرمی رخ می دهد.
نمایش تمام سازندگان تجهیزات الکتروفورز ژل
شرح فرآیند
قبل از شروع الکتروفورز، کاربر یک ژل مایع را آماده و خنک می کند، آن را در سینی می ریزد و آن را با یک شانه دندانه دار قرار می دهد تا برای هر نمونه جدایی ایجاد کند. سپس یک مایع بافر حاوی یون‌های رسانا به ژل جامد شده اضافه می‌شود تا جریان جریان را حفظ کند و PH ثابت را حفظ کند. کاربر یک نمونه اسید نوکلئیک رنگ شده یا پروتئین را به ژل تزریق می کند و منبع تغذیه جریان الکتریکی را از آن عبور می دهد. مولکول های بزرگتر و طولانی تر به آرامی بین قطب های عرضه منفی و مثبت حرکت می کنند، در حالی که مولکول های کوچکتر و کوتاهتر با سرعت بیشتری حرکت می کنند. بنابراین، مولکول‌های با اندازه‌های متفاوت نوارهای مشخصی را در ژل تشکیل می‌دهند که آنالیز می‌شوند یا با زنجیره‌های اسیدی دیگر مقایسه می‌شوند.
ژل به عنوان یک محیط ضد همرفت و الک در فرآیند الکتروفورز عمل می کند. به عنوان یک ماده ضد همرفت، تجمع گرما ناشی از جریان جریان را سرکوب می کند. ژل به عنوان یک غربال حرکت مولکول ها را به تاخیر می اندازد و به دلیل ساختار ماتریکسی خود جداسازی نهایی را حفظ می کند.
دناتوره در مقابل بومی
ژل الکتروفورز بسته به آنالیز مورد نظر ممکن است دناتوره یا بومی باشد. دناتوره شدن ساختار طبیعی آنالیت را مختل می کند و با افزودن مواد شیمیایی به محلول بافر باعث می شود اسیدها و پروتئین ها به زنجیره های ساده باز شوند. افزودنی های دناتوره کننده معمولی اوره برای اسیدهای نوکلئیک و سدیم دودسیل سولفات (SDS) برای پروتئین ها هستند.
اثر SDS بر یک زنجیره پروتئینی.
الکتروفورز طبیعی ساختار طبیعی آنالیت را در طول جداسازی حفظ می کند تا تجزیه و تحلیل زیست مولکولی پیچیده تری انجام شود. کمپلکس های مولکولی همانطور که در نمونه وجود دارند به صورت خوشه ای یا چین خورده باقی می مانند. این فرآیند به دلیل دشواری در تعیین تأثیر شکل و اندازه یک مولکول بر تحرک آن، اغلب پیچیده تر و غیرقابل پیش بینی است.
ابعاد
الکتروفورز ممکن است یک یا دو بعدی باشد. الکتروفورز یک بعدی شامل یک جداسازی است که در بالا توضیح داده شد، در حالی که فرآیند دو بعدی جداسازی دوم را برای طبقه‌بندی مولکول‌ها با پارامتر دیگری اضافه می‌کند. خواص جداسازی مولکول ها شامل جرم، نقطه ایزوالکتریک یا جرم پیچیده در حالت طبیعی است. از آنجایی که بعید است مولکول ها از نظر دو ویژگی متفاوت مشابه باشند، الکتروفورز 2 بعدی معمولاً در مقایسه با 1-D تکنیک جداسازی مؤثرتری است.
انواع فرآیند
چندین نوع فرآیند الکتروفورز خاص وجود دارد که بر اساس نوع ژل، نوع جداسازی یا نوع شوینده دناتوره طبقه بندی می شوند.
الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها، اغلب به صورت جرمی است. همانطور که از نام آن پیداست، PAGE از یک ژل پلی آکریل آمید استفاده می کند که برای جداسازی پروتئین ایده آل است، اما همچنین قدرت تفکیک بالایی را برای قطعات کوچک DNA فراهم می کند.
SDS-PAGE یک فرآیند الکتروفورز پروتئین رایج است که از SDS به عنوان یک عامل دناتوره کننده استفاده می کند. کاربردهای آن شامل تعیین وزن مولکولی، شناسایی پروتئین ها، تعیین خلوص نمونه، شناسایی وجود پیوندهای دی سولفیدی، و تشخیص یا تخمین تنوع ژنتیکی در یک نمونه است.
تمرکز ایزوالکتریک (IEF) مولکول ها را با بار الکتریکی جدا می کند و اغلب با SDS-PAGE در یک فرآیند دو بعدی که شامل جداسازی توسط نقطه ایزوالکتریک و به دنبال آن جرم است، جفت می شود. در فرآیند IEF یک آمفولیت به ژل آکریل آمید با گرادیان pH بی حرکت (IPG) اضافه می شود. پروتئین های داخل ژل IPG به نوارهای pH که با نقطه ایزوالکتریک آنها مطابقت دارد مهاجرت می کنند. IEF/SDS-PAGE دوبعدی برای تجزیه و تحلیل مخلوط‌های پروتئینی پیچیده یا رفتارهای بافتی، مشخص کردن جزئی پروتئین‌ها، مقایسه حالت‌های مختلف فیزیولوژیکی همان بافت، و خالص‌سازی پروتئین‌ها برای تجزیه و تحلیل بیشتر استفاده می‌شود.
انواع تجهیزات
سیستم های کامل
مجموعه‌ها یا کیت‌های کامل الکتروفورز شامل بیشتر لوازم مورد نیاز برای فرآیند می‌شود. اینها ممکن است شامل ترکیبی از سینی های ژل، رنگ ها، کیت های نمونه و مواد آنالیز باشد. برخی از سیستم‌های کاملاً خودکار شامل منبع تغذیه و نرم‌افزار تجزیه و تحلیل هستند به طوری که کاربر فقط باید نمونه‌های آنالیت را تهیه کند.
نوع فرآیند، مانند SDS-PAGE و IEF، و جهت گیری دو روش رایج برای توصیف سیستم ها هستند. در حالی که PAGE و IEF فرآیندهای مشابهی هستند، از تجهیزات و لوازم جانبی متفاوتی استفاده می کنند. به عنوان مثال، سیستم های IEF ممکن است شامل محلول آمفولیت مورد نیاز یا یک دستگاه آماده سازی تخصصی برای ژل یا نمونه ها باشد.
جهت گیری سیستم عمودی یا افقی است. سینی های افقی (همچنین به عنوان تخت مسطح شناخته می شود) مستطیل شکل هستند و برای تجزیه و تحلیل نمونه های با حجم بالا ایده آل هستند. سیستم های عمودی از ژل ها و سینی های ستونی برای تجزیه و تحلیل مقادیر مختلف نمونه کوچک استفاده می کنند. گاهی اوقات سیستم های افقی به دلیل توانایی آنها در توزیع یکنواخت گرما در کل سطح ژل سودمند در نظر گرفته می شوند. توزیع نابرابر گرما می تواند باعث ایجاد نوارهای مولکولی تابیده شود که در نتیجه اثرات "خندان" همانطور که در سمت راست نشان داده شده است.
اجزاء
قطعات الکتروفورز اغلب به طور جداگانه فروخته و خریداری می شوند. تجهیزات متداول شامل رنگ‌ها، سینی‌ها، منابع تغذیه، الکترودها، کابل‌ها، مخلوط‌های ژل، خشک‌کن‌های ژل و مواد شیمیایی مانند عوامل دناتوره‌کننده، سخت‌کننده‌های ژل و آمفولیت‌ها است.
انتخاب یک ژل مناسب برای فرآیند الکتروفورز بسیار مهم است. ژل ها در یک ژل انباشته بالایی و ژل جداکننده/حل کننده پایینی قرار می گیرند. لایه انباشته آکریل آمید کم است و PH پایینی دارد، در حالی که لایه جداکننده غلظت آکریل آمید بالاتر و pH بالاتری دارد. تفاوت بین دو لایه منجر به وضوح بالا و نوارهای متمایزتر برای اندازه گیری آسان تر می شود.
سه نوع ژل در فرآیند الکتروفورز استفاده می شود:
ژل های آگارز دارای وضوح پایین اما محدوده تفکیک بالایی هستند. آنها در تجزیه و تحلیل قطعه DNA استفاده می شوند.
ژل های پلی آکریل آمید برای تجزیه و تحلیل پروتئین و DNA قطعات کوچک استفاده می شود.
ژل های نشاسته از نشاسته سیب زمینی نیمه هیدرولیز شده تشکیل می شوند. آنها کمی مات تر از انواع آگارز یا پلی آکریل آمید هستند و برای الکتروفورز پروتئین استفاده می شوند.
منبع